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Le dépérissement bactérien de l'anthurium (Anthurium andreanum) provoqué par Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae : mise au point d'une BIO-nested PCR pour la certification

Laurent P., Robène-Soustrade I., Legrand D., Gagnevin L., Jouen E., Pruvost O.. 2006. In : SFP. 7èmes Rencontres plantes-bactéries, 20-23 mars 2006, Aussois, France. Résumés. Angers : INRA, p. 94-94. Rencontres plantes-bactéries. 7, 2006-03-20/2006-03-24, Aussois (France).

Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae (Xad) est l'agent du dépérissement bactérien de l'anthurium, sévère maladie systémique rencontrée dans la plupart des zones de culture de cette Aracée. Les stratégies de lutte actuelles consistent essentiellement en l'application de mesures prophylactiques ainsi que l'utilisation d'un matériel sain issu de la culture in vitro. Dans une optique de certification, une nested-PCR a été développée à partir d'un fragment d'ADN isolé par RAPD-PCR (1). La protéine putative codée par ce fragment présente des homologies avec un ABC transporteur codé par wzt du cluster LPS chez Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. Cet outil moléculaire permet le diagnostic de Xad en culture pure, et détecte la bactérie directement sur broyat de tissus végétaux infectés. Afin de déterminer la sensibilité de ce test sur extrait végétal, nous avons réalisé des inoculations de Xad sur anthurium puis nous avons analysé au cours du temps la présence de la bactérie par nested-PCR. Soixante-douze plants d'anthurium ont été infectés par aspersion de la surface foliaire à l'aide d'une suspension bactérienne à 107 cfu/ml. Un lot de 36 plants inoculés a été conservé intact pour noter l'évolution des symptômes au cours du temps. Un prélèvement de 3 feuilles a été réalisé tous les 2 jours sur deux plants choisis au hasard parmi les 36 plants restants. Les pourtours de chacune des feuilles ont été broyés dans du tampon d'extraction contenant du PVP. Sur chacun des broyats ont été réalisés une détection par nested-PCR ainsi que des étalements sur les milieux LPGA et semi-sélectif CS (2). La nested-PCR permet la détection de la bactérie dès 4 jours après inoculation, soit 12 jours avant l'apparition des premiers symptômes. Le seuil de détection par la nested-PCR se situe à 103 cfu/mI, soit 2.104 cfu/g de tissus. Afin d'appliquer ce test dans une procédure de certification, pour laquelle des regroupements d'échantillons sont nécessaires en vue de diminuer le nombre d'analyses, nous avons rajouté une étape d'enrichissement en milieu liquide de la bactérie cible avant sa détection moléculaire. Un bouillon semi sélectif contenant 5 antibiotiques a été mis au point permettant l'inhibition de la croissance de plus de 86% des bactéries saprophytes retrouvées sur anthurium. Des expériences de co-cultures ont montré que les souches susceptibles de se développer sur ce milieu n'empêchaient pas la croissance et la détection de Xad. Le taux de croissance de Xad à 28°C sur ce milieu a été déterminé afin de connaître la durée d'incubation théorique nécessaire pour obtenir une population détectable par PCR (103 cfu/ml) à partir d'une seule cellule. Ce protocole a été testé par incubation de broyats de feuilles d'anthurium en présence de différentes dilutions du pathogène et d'autres bactéries. Des comptages bactériens et des tests PCR ont permis de valider cette technique comme permettant de garantir l'absence du pathogène dans l'échantillon testé. Une étude portant sur le plan d'échantillonnage (prélèvement pour une détection optimale, regroupement des échantillons) a été réalisée. Une étude statistique a permis de déterminer le nombre de feuilles à analyser afin de pouvoir diagnostiquer la bactériose avec une probabilité de 0,99 pour une incidence de la maladie de 1%. Ce protocole a été utilisé lors de la sortie de quarantaine d'un lot de 5000 plants d'anthurium dans le cadre du transfert de la technique au Service de Protection des Végétaux. Elle a permis de déclarer ce lot indemne de la maladie. (Texte intégral)...
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