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Caracterização molecular e expressão em bactéria de uma cisteínoprotease de Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa

Santana Cardoso T.H., Micheli F., Pirovani C.P., De Mattos Cascardo J.C., Da Silva Gesteira A.. 2009. In : XV Seminario de Iniciaçao Cientifica e X Semana de Pesquisa e Pos-Graduaçao, Ilheus, Brazil, 20-23 de octubre 2009. s.l. : s.n., 1 p.. Seminário de Iniciação Científica. 15, 2009-10-20/2009-10-23, Ilhéus (Brésil).

O fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer, agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), é atualmente o maior problema fitopatológico das regiões produtoras de cacau. A complexidade do patossistema cacau-M. perniciosa e os prejuízos causados pela doença motivaram estudos genômicos e proteômicos do fungo e da interação. Em bibliotecas de cDNA das interações T. cacao-M. perniciosa resistente e susceptível, sequenciadas na UESC, foram detectados fragmentos gênicos de diferentes classes de proteases. Esse trabalho objetivou a caracterização molecular do gene TcCysPr04 e a expressão da respectiva proteína em bactéria. Análises de bioinformática revelaram que o gene possui uma ORF de 526 pb, que codifica uma proteína com 171 aminoácidos, com PM estimado de 19,1 kDa e pI de 8,6. Análises com o programa signalP 3.0 indicou a presença de um peptídeo sinal com provável sitio de clivagem entre os aminoácidos 19 e 20, e, análises com os programas TargetP e PSORT indicaram a provável secreção da proteína para o apoplasto ou localização vacuolar, como ocorre com cisteíno proteases do grupo das aleurinas. A sequencia aminoacídica de TcCisPr04 foi alinhada com outras proteases do gene bank e agrupou com o domínio inibitório de cisteíno-proteases envolvidas em reação de hipersensibilidade a patógenos. Análise no Pfam e ProDom indicou que o domínio inibitório contém 56 aminoácidos, localizados entre as coordenadas 56 e 112. O domínio inibitório da TcCisPr04 foi clonado em pET28a, sob controle do promotor da T7 RNA Polmerase. A proteína foi expressa na estirpe de E. coli, BL21(DE3), e induzida com IPTG a 1 mM. A expressão heteróloga do domínio inibitório foi visualizada em gel SDS-PAGE 15% e uma banda com massa molecular esperada de aproximadamente 19 kDa foi observada. A proteína purificada por cromatografia em colunas contendo níquel e não exibiu atividade inibitória sobre a papaína do mamão em ensaios com o substrato cromogênico BApNA. Além disso, a proteína também não afetou o crescimento de hifas do fungo M. perniciosa. Ensaios ainda precisam ser realizados para avaliar se esta proteína é da classe regulatória dos zimógenos ou esse domínio inibitório exibe interação com o domínio catalítico, mesmo após clivagem proteolítica.

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