Identificação e clonagem de uma protease em uma biblioteca de cDNA da interação Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa
Cardoso T.H.S., Almeida D.S.M., Micheli F., Cascardo J.C.M., Pirovani C.P.. 2009. In : SBG. Resumos do 55e Congresso Brasileiro de Genética, 30 de agosto a 02 de setembro de 2009, Aguas de Lindoia, Brasil. Ribeirao Preto : s.n., p. 98-98. Congresso Brasileiro de Genética. 55, 2009-08-30/2009-09-02, Aguas de Lindoia (Brésil).
O fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer (= Crinipellis), agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), é atualmente o maior problema fitopatológico das regiões produtoras de cacau. A complexidade do patossistema cacau-M. periniciosa e os prejuÃzos causados pela vassoura-de-bruxa motivaram estudos genômicos e proteômicos do fungo e da interação. Em bibliotecas de cDNA das interações T. cacao-M. perniciosa resistente e suscetÃvel, sequenciadas na UESC, foram detectados fragmentos de diferentes classes de proteases. Um gene de cisteÃno-protease do tipo papaÃna (TcCisPr04) foi completamente seqüenciado. Esse gene possui uma ORF de 1068 pb, que codifica uma proteÃna com 356 aminoácidos, com peso molecular estimado de 39 kDa e pI de 5,43. A sequencia aminoacÃdica de TcCisPr04 foi alinhada com outras proteases e do gene bank e agrupou com cisteÃno-proteases envolvidas em reação de hipersensibilidade a patógenos. Análises com o programa signalP 3.0 indicou que a proteÃna possui um peptÃdeo sinal com provável sitio de clivagem entre os aminoácidos 19 e 20 e análises com os programas TargetP e PSORT indicaram provável secreção para o apoplasto ou localização vacuolar. Análise no Pfam e ProDom indicou um domÃnio inibitório contendo 56 aminoácidos, na região amino-terminal e um domÃnio catalÃtico de 218 aminoácidos na região carboxi-terminal da proteÃna. O domÃnio inibitório da TcCisPr04 foi clonado em pET28a, sob controle do promotor da T7 RNA Polmerase e do Operador lac. A proteÃna correspondente foi expressa na estirpe de E. coli, BL21(DE3), e induzida com IPTG a 1 mM. A expressão heteróloga do domÃnio inibitório foi visualizada em gel SDS-PAGE 15% e uma banda com massa molecular esperada de aproximadamente 19 kDa foi observada. A proteÃna heteróloga purificada por cromatografia em colunas contendo nÃquel inibiu a atividade de papaÃna em ensaios com o substrato cromogênico BApNA. Os parâmetros cinéticos da inibição estão sendo determinados
Mots-clés : theobroma cacao; moniliophthora; génétique; brésil; moniliophthora perniciosa; protéomique
Documents associés
Communication de congrès
Agents Cirad, auteurs de cette publication :
- Micheli Fabienne — Bios / UMR AGAP