Onde é cultivado, o cacaueiro (Theobroma cacao L.) é alvo de várias doenças de grande impacto econômico. Entre estas estão a vassoura-de-bruxa (Moniliophthora perniciosa), podridão-parda (Phytophthora spp.), monilíase (Moniliophthora roreri) e a murcha de Ceratocystis (Ceratocystis cacafunesta). O conhecimento da biologia destes fitopatogenos é essencial para estabelecer um manejo eficiente das doenças. As limitações metodológicas para seqüenciamento de genes de interesse têm sido a extração do DNA e a amplificação de regiões especificas com qualidade satisfatória, ou seja, que permitam o uso com sucesso dos produtos da amplificação em reações de seqüenciamento e em métodos moleculares comparativos. Nesse sentido, nosso objetivo foi determinar as condições ótimas das reações de PCR para amplificação de regiões ribossomais, dentre outras, as quais vêm sendo usadas rotineiramente no FITOMOL no auxilio da taxonomia molecular e filogenia destes fitopatogenos. Isolados de quatro espécies de fungos em estudo (M. perniciosa, Phytophthora spp., M. roreri e Ceratocystis cacaofunesta) tiveram seu DNA extraído segundo protocolos específicos para cada espécie. O DNA foi quantificado e determinado sua qualidade utilizando gel de agarose a 1%. A otimização das condições da PCR foi avaliada segundo dois aspectos: concentração final do DNA template na reação (10, 25 e 50 ng/ul) e concentração dos primers (4, 10 e 20 pmol/ul) em reações com volumes finais de 20 ul e 50 ul. Os resultados demonstram que as condições ótimas para amplificação das regiões em estudo é uma reação com volume final de 20 ul, 10 ng/ul de DNA template e concentração do primer a 4 pmol/ul, Os resultados mostram que uma menor concentração de DNA deve ser utilizada, o que é desejável levando em consideração as dificuldades de obtenção de micélio e extração do DNA em fungos, bem como uma economia em relação aos reagentes utilizados na PCR. Esta abordagem provou ser de sucesso para amplificação de